3月5日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陶小榮教授團隊聯(lián)合中國科學(xué)院生物物理研究所王祥喜研究員團隊，在全球植物學(xué)頂級期刊《Nature Plants》在線發(fā)表突破性研究成果，首次解析番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus,TSWV）RNA復(fù)制酶全長三維結(jié)構(gòu)，為靶向抗病毒新農(nóng)藥研發(fā)開辟全新路徑。這項歷時六年的研究攻克了植物病毒學(xué)領(lǐng)域復(fù)制酶結(jié)構(gòu)解析的重點難題，揭示了復(fù)制酶激活及其雙靶點抑制的分子機制，使人們得以窺見植物病毒遺傳物質(zhì)復(fù)制機器的“廬山真面目”。

植物病毒作為一類新的病原體被發(fā)現(xiàn)已有一個多世紀(jì)，當(dāng)前已成為危害全球農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一類重要病原物，每年造成的經(jīng)濟損失超過600億美元，目前還沒有有效的抗植物病毒藥劑。植物病毒百分之八十以上是RNA病毒，它們都編碼一個高度保守的RNA復(fù)制酶催化合成病毒的基因組RNA，是病毒生命周期中遺傳物質(zhì)復(fù)制的關(guān)鍵蛋白酶。因此，病毒RNA復(fù)制酶是領(lǐng)域內(nèi)公認(rèn)的非常理想的抗病毒藥劑靶標(biāo)。盡管國際病毒分類委員會正式認(rèn)定的植物病毒種類迄今已超過2100種，但尚無一例植物病毒完整復(fù)制酶蛋白的三維結(jié)構(gòu)信息。原子水平上對植物病毒復(fù)制激活與調(diào)控機制等具體過程認(rèn)識的不足，嚴(yán)重制約了植物病毒靶向藥物的設(shè)計與研發(fā)。

番茄斑萎病毒RNA復(fù)制酶激活及其雙靶點抑制機制模式圖

“巧婦難為無米之炊，我們終于逮到這個大家伙去下鍋了”，論文共同第一作者李佳副教授回憶起當(dāng)時獲得TSWV RNA復(fù)制酶全長蛋白時仍非常興奮。在超過2100種的植物病毒中，TSWV是最具經(jīng)濟重要性和科學(xué)重要性的十大植物病毒之一，能侵染85科1000多種植物，其編碼的RNA復(fù)制酶（也稱作L蛋白）分子量巨大，全長蛋白高達(dá)330 kDa，是目前已知所有植物病毒中最大的RNA復(fù)制酶之一，表達(dá)極為困難。研究人員通過對核酸序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化、促溶標(biāo)簽摸索以及篩選不同表達(dá)系統(tǒng)等，最終利用昆蟲Hi-five細(xì)胞成功純化獲得了毫克級別的高純度蛋白樣品，克服了330 kDa全長蛋白的表達(dá)瓶頸。借助冷凍電鏡技術(shù)，團隊成功捕獲了復(fù)制酶未結(jié)合底物的失活態(tài)、結(jié)合病毒RNA后的激活態(tài)以及結(jié)合抗病毒藥物后的抑制態(tài)結(jié)構(gòu)特征，繪制出首張完整植物病毒復(fù)制酶三維圖譜。

結(jié)構(gòu)信息顯示TSWV RNA復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域組成相對目前已知的人和動物病毒復(fù)制酶更為復(fù)雜，總體可參考流感病毒聚合酶劃分為三個主要區(qū)域：N端的核酸內(nèi)切酶區(qū)域、中央核心區(qū)的RNA聚合酶區(qū)域以及C端包含抓帽結(jié)構(gòu)域的可變區(qū)。核心區(qū)域的結(jié)構(gòu)保守性揭示了植物病毒與動物病毒的共同進(jìn)化起源；N端和C端結(jié)構(gòu)域顯著大于其它已解析的同類病毒復(fù)制酶結(jié)構(gòu)域，并具有獨特的結(jié)構(gòu)特征。通過深度挖掘分析以及功能驗證，發(fā)現(xiàn)了一個在所有布尼亞病毒的復(fù)制酶催化中心高度保守的新基序I，這是自2015年基于人類病毒（拉克羅斯病毒）研究發(fā)現(xiàn)新基序G和H以來，基于植物病毒研究再度發(fā)現(xiàn)新的酶活中心關(guān)鍵保守基序，為病毒學(xué)領(lǐng)域全面認(rèn)識病毒RNA復(fù)制酶的結(jié)構(gòu)特征提供了新的認(rèn)識。

研究發(fā)現(xiàn)TSWV RNA復(fù)制酶催化中心保守基序F的柔性環(huán)在未結(jié)合病毒基因組RNA時處于高度無序狀態(tài)，當(dāng)加入病毒基因組RNA保守序列后，保守基序F可發(fā)揮“傳感器”作用感知病毒基因組RNA末端的保守順式作用元件，并穩(wěn)定柔性環(huán)；結(jié)構(gòu)穩(wěn)定后的保守基序F與保守基序I等發(fā)生相互作用，進(jìn)一步作為“適配器”促進(jìn)完整催化中心的形成，使復(fù)制酶處于激活狀態(tài)。“我們破解了病毒自我激活的分子開關(guān)。”共同第一作者曹磊副研究員指出，病毒基因組5’末端10個堿基長度的RNA序列形成的“鉤”狀結(jié)構(gòu)是觸發(fā)復(fù)制酶激活的關(guān)鍵。研究還發(fā)現(xiàn)核苷類藥物利巴韋林及其代謝物利巴韋林三磷酸鹽能通過雙靶點抑制機制阻斷這一過程，完全抑制TSWV在植物中的復(fù)制侵染；結(jié)構(gòu)與生化數(shù)據(jù)表明利巴韋林及其三磷酸鹽均能特異性靶向TSWV RNA復(fù)制酶上RNA“鉤”狀結(jié)構(gòu)結(jié)合空腔的進(jìn)入通道和酶活催化中心。

“長期以來，種植抗病品種和使用殺蟲劑控制傳毒媒介昆蟲是生產(chǎn)上預(yù)防病毒侵染和減少病害損失的主要手段。然而，對于已經(jīng)感染病毒的植物，基本無藥可用。番茄斑萎病毒RNA復(fù)制酶結(jié)構(gòu)的解析填補了植物病毒復(fù)制酶結(jié)構(gòu)生物學(xué)的空白。研究揭示的獨特雙靶點抑制機制不僅對植物病毒農(nóng)藥也對人和動物中的分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒抑制劑研發(fā)提供了非常重要的靶點。”論文通訊作者之一陶小榮教授介紹。目前，研究成果已申請專利，研究團隊正基于結(jié)構(gòu)信息以及關(guān)鍵靶點建立小分子化合物篩選平臺，與國內(nèi)多家單位開展合作研發(fā)。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林生物安全全國重點實驗室李佳副教授和中國科學(xué)院生物物理研究所曹磊副研究員為該論文的共同第一作者，中國科學(xué)院生物物理研究所王祥喜研究員和南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)林生物安全全國重點實驗室陶小榮教授為共同通訊作者。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博士研究生趙雅倩、碩士研究生沈靜涵以及中科院生物物理所博士研究生王磊參與了本研究。荷蘭瓦赫寧根大學(xué)Richard Kormelink教授、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)葉永浩教授、朱敏副教授、馮明峰博士為本研究提供了重要幫助。研究工作得到了國家杰出青年基金、國家自然科學(xué)基金重點項目、以及江蘇省自主創(chuàng)新基金等項目經(jīng)費的資助。

論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41477-025-01940-y