近日，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)江蘇省家畜胚胎工程研究中心/動物科技學(xué)院肉羊創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)萬永杰教授和張艷麗教授課題組在Protein & Cell期刊在線發(fā)表了題為“An upgraded nuclease prime editor platform enables high-efficiency singled or multiplexed knock-in/knockout of genes in mouse and sheep zygotes”的研究成果。該研究在基因編輯技術(shù)研究領(lǐng)域取得重要進(jìn)展，成功利用升級后的核酸酶先導(dǎo)編輯器（uPEn）在湖羊中實(shí)現(xiàn)MSTN/PPARG雙基因高效編輯，為畜禽基因編輯育種提供了新的技術(shù)手段。

CRISPR-Cas基因組編輯技術(shù)的問世，為精準(zhǔn)遺傳操作打開了大門。在這一領(lǐng)域不斷的探索中，2019年開發(fā)的“先導(dǎo)編輯”（Prime Editing，PE）技術(shù)實(shí)現(xiàn)了重要突破，其通過結(jié)合帶有逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）結(jié)構(gòu)域的Cas9缺口酶融合蛋白和先導(dǎo)編輯向?qū)?/span>RNA（pegRNA），在DNA上實(shí)現(xiàn)小型精準(zhǔn)編輯。盡管PE技術(shù)展現(xiàn)出廣泛的應(yīng)用前景，尤其在畜牧育種領(lǐng)域，可用于引入有利基因型促進(jìn)種質(zhì)創(chuàng)新，但其在動物受精卵中的編輯效率較低，限制了實(shí)際應(yīng)用。

為了應(yīng)對這一挑戰(zhàn)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院萬永杰教授和張艷麗教授團(tuán)隊(duì)與南京大學(xué)劉江懷教授團(tuán)隊(duì)合作，嘗試運(yùn)用一種基于核酸酶PE變體（PEn）的新型工具uPEn。該工具集成了一個輔助DNA修復(fù)途徑的調(diào)節(jié)模塊（i53），在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中展現(xiàn)出顯著優(yōu)于傳統(tǒng)PE和PEn工具的編輯效率。

研究人員首先在細(xì)胞中對比了全長和拆分版本的uPEn，結(jié)果顯示兩種形式均能實(shí)現(xiàn)基因小片段的精準(zhǔn)敲入。隨后，團(tuán)隊(duì)將RNA形式的uPEn注射至小鼠受精卵中，成功在脂肪代謝相關(guān)基因Pparg（γ2）的上游插入優(yōu)化Kozak序列，獲得了可穩(wěn)定遺傳的編輯小鼠（founder）。純合小鼠的F2代細(xì)胞中，PPARγ2蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，這一發(fā)現(xiàn)證實(shí)了uPEn在基因表達(dá)調(diào)控中的應(yīng)用價值。

接下來，研究人員在湖羊受精卵中用全長或拆分uPEn，分別針對PPARG基因進(jìn)行Kozak基序敲入，同時靶向敲除MSTN基因?；蛐头治鼋Y(jié)果顯示，uPEn在PPARG處有效地敲入了Kozak基序（8/15羔羊，每只編輯羔羊的正確編輯率的中位數(shù)為50.11%），并且6只羔羊同時達(dá)成了雙基因編輯（6/15），進(jìn)一步證實(shí)了uPEn工具在多位點(diǎn)基因編輯中的強(qiáng)大靈活性。

此次研究成功獲得了雙基因敲入/敲除的湖羊，為進(jìn)一步探索基因編輯對產(chǎn)肉量和肉質(zhì)性狀的影響奠定了基礎(chǔ)。這些研究成果表明，uPEn在畜牧業(yè)種質(zhì)創(chuàng)新中的巨大潛力，為精準(zhǔn)育種提供了全新工具。后期研究有待進(jìn)一步降低uPEn核酸酶活性所導(dǎo)致的部分非準(zhǔn)確編輯以及優(yōu)化其編輯保真性。未來，基因編輯技術(shù)的持續(xù)發(fā)展將進(jìn)一步推動精準(zhǔn)育種和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，為全球糧食安全和畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供有力支持。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)為第一署名單位和通訊單位，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院碩士研究生冒魏佳和南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院模式所博士研究生王佩為該研究的共同第一作者，萬永杰教授（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)）、劉江懷教授（南京大學(xué)）、張艷麗教授（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)）為共同通訊作者。該研究得到了南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院王鋒教授、浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院黃興許教授、之江實(shí)驗(yàn)室研究專家婁鑫、碩士生周磊、博士生李東旭、博士生李向陽的參與支持。此外，研究還得到了國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021YFF1000700和2019YFA0802802）和國家自然科學(xué)基金（32172735）的資助。該技術(shù)已申請國家發(fā)明專利（申請?zhí)枺?/span>202410315649.6）。

原文鏈接：https://doi.org/10.1093/procel/pwaf006